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HPLC kleiner Moleküle

Wissenschaftler, der sich ein HPLC-Chromatogramm anschaut

Analytik kleiner Moleküle

Ein kleines Molekül bezieht sich auf eine Verbindung mit niedrigem Molekulargewicht (typischerweise weniger als 900 Dalton). Einige gängige Beispiele für kleine Moleküle sind Aminosäuren, Lipide, Zucker, Fettsäuren und Alkaloide.

Für die Trennung kleiner Moleküle stehen verschiedene Methoden zur Verfügung, darunter Hochleistungsflüssigchromatographie (HPLC), Flüssigchromatographie (LC), Gaschromatographie (GC), Dünnschichtchromatographie (DC) und Kapillarelektrophorese (CE). Optionen für ihre Identifizierung sind unter anderem die kernmagnetische Resonanzspektroskopie (NMR) oder die Massenspektrometrie (MS). Die mit der Massenspektrometrie gekoppelte Flüssigchromatographie (LC-MS) wurde in den letzten Jahren zu einer Schlüsseltechnik für die Identifizierung kleiner Moleküle.

Das Erzielen bestmöglicher Ergebnisse in der Hochleistungsflüssigchromatographie (HPLC), UHPLC oder LC-MS-Analyse kleiner Moleküle hängt von der Auswahl der am besten geeigneten stationären Phase und den Bedingungen der mobilen Phase ab. Die Chemie des Analyten zu beachten ist der wesentlichste Faktor bei der Auswahl der am besten geeigneten Säulenchemie. Durch andere Aspekte wie Geschwindigkeit, Probenmatrix und Anzahl der Verbindungen wird das am besten geeignete Basismaterial für die stationäre Phase definiert.

HPLC kleiner Moleküle

Die HPLC-Analyse von kleinen Molekülen wird überwiegend im Umkehrphasen-Trennmodus durchgeführt. Für die Trennung von polaren Verbindungen eignen sich die hydrophile Interaktionschromatographie (HILIC) und die Normalphasenchromatographie, wobei HILIC die bevorzugte Methode ist. Für die Trennung ionischer Verbindungen kann auch die Ionenaustausch-Chromatographie und für anorganische Kationen oder Anionen die Ionenchromatographie eingesetzt werden.

Die HPLC-Säule ist entweder mit vollporösen Kieselgelpartikeln, superficially porous silica Partikeln oder Polymerpartikeln gepackt oder besteht aus einem monolithischen Kieselgelstab als stationärer Phase. Darüber hinaus werden Aluminiumoxid, Zirkoniumdioxidpartikel und Kohlenstoffpartikel verwendet. Die typische Porengröße des Materials der stationären Phase für die Trennung kleiner Moleküle liegt im Bereich von 60 Å - 160 Å. Bei der HPLC reicht die typische Partikelgröße der stationären Phase von 3 µm bis 5 µm, bei der UHPLC werden kleinere Partikelgrößen, üblicherweise 2 µm oder weniger, verwendet. An der stationären Phase können verschiedene Säulenmodifikationen (Selektivitäten) angebracht werden. Eine C18-Alkylkette ist die am häufigsten verwendete Säulenchemie in der Umkehrphasenchromatographie (reversed phase - RP). Nichtsdestotrotz ermöglichen andere Modifikationen, wie z. B. C30, C8, Phenyl, Pentafluorphenyl und eine breite Palette von stärker polaren Modifikationen sowie Modifikationen mit Ionenaustausch- oder chiralen Eigenschaften die Trennung fast aller löslichen Verbindungen. Die mobile Phase für die RP-HPLC besteht typischerweise aus einem wässrigen Puffer oder Wasser und mit Wasser mischbaren organischen Lösungsmitteln wie Acetonitril oder Methanol.

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Probenvorbereitung in der HPLC

Komplexe und matrixreiche Proben, wie z. B. Lebensmittel, Getränke, Kosmetika, biologische Proben bzw. matrixreiche pharmazeutische Formulierungen (z. B. Creme, Sirup) erfordern effiziente Methoden zur Probenvorbereitung, um unerwünschte Bestandteile zu entfernen und den Zielanalyten selektiv abzutrennen. Dies ist besonders dann wichtig, wenn es sich um eine stationäre Phase mit sehr kleinen Partikelgrößen wie bei der UHPLC handelt, in der Partikel von 2 µm Durchmesser oder weniger verwendet werden. Gängige Probenvorbereitungsmethoden sind Flüssig-Flüssig-Extraktion, Festphasenextraktion (SPE) und, bei biologischen Proben, neben der Filtration auch die Proteinfällung. Neben der selektiven Elution des Analyten und seiner Aufkonzentration besteht der Hauptzweck der Probenvorbereitung darin, die stationäre HPLC-Phase vor Verstopfung durch die Probenmatrix zu schützen. HPLC-Säulen auf der Basis von monolithischem Kieselgel können Matrix in hohem Maße tolerieren und erfordern viel weniger Aufwand bei der Probenvorbereitung als partikuläre Säulen.

Derivatisierung

Bei einigen Molekülen ist eine Derivatisierung erforderlich, entweder vor (Vorsäulenderivat) oder nach (Nachsäulenderivat) der HPLC-Trennung. Durch die Derivatisierung werden Moleküle in ihre Derivate umgewandelt, um eine höhere Empfindlichkeit oder chromatographische Retention in der HPLC zu erreichen. Für die erforderliche Derivatisierung werden geeignete chemische Reagenzien zur Einbringung der erwünschten physikalischen und chemischen Eigenschaften verwendet.

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