Clonage et expression

Vecteurs d'expression protéique

Les plasmides ou vecteurs d'expression de protéines sont des morceaux d'ADN circulaires qui contiennent de nombreux éléments fonctionnels pour le clonage et l'expression de la protéine d'intérêt. Le choix du vecteur d'expression adapté dépend en partie du type de protéine, de l'organisme dans lequel elle sera exprimée, de l'application et des questions scientifiques que les chercheurs se proposent d'examiner. Le vaste éventail de vecteurs d'expression disponibles permet aux chercheurs de choisir les éléments de clonage, de sélection clonale et d'expression protéique qui conviennent le mieux à leur étude. Une fois la séquence génétique d'intérêt et le vecteur d'expression sélectionnés, les chercheurs utilisent généralement des nucléases pour couper le vecteur avec précision au niveau de sites spécifiques. Ils peuvent alors cloner la séquence d'intérêt en phase, et enfin, l'exprimer dans un organisme hôte. Les chercheurs utilisent souvent des cellules chimiocompétentes et une transformation bactérienne pour servir d'hôte aux plasmides d'ADN recombinant, car elles sont stables lorsqu'elles sont congelées à -70 °C.

Transfection des cellules

La transfection cellulaire consiste à introduire de l'ADN, de l'ARN ou des protéines dans des cellules eucaryotes. Les chercheurs disposent d'un arsenal de technologies physiques, chimiques et biologiques pour accomplir cette étape de la procédure d'expression des protéines. Les méthodes physiques (p. ex. électroporation) et chimiques (p. ex. phosphate de calcium, polyéthylèneimine, réactifs de lipofection) sont couramment utilisées par les chercheurs. Ces derniers disposent également de systèmes de transduction virale, notamment des vecteurs lentiviraux, oncorétroviraux et adénoviraux. Cependant, pour des raisons de biosécurité, l'utilisation de vecteurs viraux nécessite souvent des mesures de confinement et de contrôle supplémentaires.

Systèmes d'expression des protéines

Divers organismes sont utilisés par les chercheurs pour exprimer la protéine d'intérêt. Les bactéries sont souvent utilisées en raison de leur capacité à incorporer efficacement les vecteurs d'expression, à se multiplier rapidement et à produire de grandes quantités de protéine recombinante dans des conditions optimales. Toutefois, étant des organismes procaryotes, les bactéries ne sont pas capables de réaliser les modifications post-traductionnelles requises par certaines protéines. Les cellules eucaryotes, notamment les levures et les lignées de cellules de mammifères, permettent la modification post-traductionnelle des protéines et sont aussi couramment utilisées par les chercheurs. Le choix de la meilleure lignée cellulaire pour l'expression des protéines recombinantes et de la stratégie d'expression protéique dépend en grande partie des besoins propres à l'application, mais aussi des questions que les scientifiques se proposent d'examiner.