Charakterisierung in der Biopharmazie

Identität

Bestimmung der intakten Masse

Die Bestimmung der intakten Molekülmasse, die häufig mit SEC-MS und auf Basis geeigneter Standards durchgeführt wird, ist ein notwendiger Schritt bei der Charakterisierung von Biologika, von der Auswahl der Klone bis zur Überprüfung des Endprodukts. Die Analyse der intakten Molekularmasse wird üblicherweise verwendet, um die Vielfalt der Protein-/Peptidprodukte nachzuweisen und die Identität von Biologika zu überprüfen. Bei entsprechender Optimierung kann sie auch dazu eingesetzt werden, das intakte Molekulargewicht aller Proteinprodukte, einschließlich bispezifischer monoklonaler Antikörper, zu bestimmen.

Anstatt mit der unhandlichen intakten Masse eines großen biologischen Proteins umzugehen, wird ein Ansatz zur Proteinverdauungsanalyse verwendet, bei dem die Probe zunächst in wenige Fragmente aufgespalten wird, woraufhin die Separation einzeln mit spezialisierten Massenspektrometrie-Proteomikstandards durchgeführt werden kann.

Titermessung

Die Produktivität der Zelllinie, ausreichende Mengen mAk zu liefern, beeinflusst ihr wirtschaftliches Potenzial. Der Titer wird unter Einsatz der Protein-A-Affinitätschromatographie (HPLC) gemessen und dient als Grundlinienmessung. Zu Beginn der Entwicklung eines mAk soll eine große Anzahl von Erntezellkulturproben (HCC) auf IgG-Titer untersucht werden. Die Affinitätschromatographie mit einem Protein-A-Liganden wird häufig zur Bestimmung der mAk-Konzentration und zur Aufreinigung für die nachgelagerte Aggregat- und Ladungsvariantenanalyse verwendet.

Aminosäureanalyse

Die Aminosäureanalyse ist eine gängige Methode zur Feststellung der Produktidentität und wird zur Bestimmung der Aminosäurezusammensetzung eines mAk eingesetzt. Sie wird häufig zusammen mit einer Messung des Extinktionskoeffizienten durchgeführt, einer Methode, die routinemäßig zur Bestimmung des Titers zwischen verschiedenen Produktionen eingesetzt wird.

Zertifizierte Referenzmaterialien mit Werten, die durch metrologisch gültige Verfahren zugewiesen werden, sind entscheidend für die Minimierung und Kontrolle von Versuchsvariationen in allen Schritten des Arbeitsablaufs der Aminosäureanalyse, einschließlich Proteinextraktion, Fraktionierung, Anreicherung, Proteolyse und Analyse.

Peptidkartierung

Um einen Hinweis auf die Identität des mAk zu erhalten, kann der Vergleich von einfachen Peptidkartierungen einzelner Enzyme ausreichen. Durch eine detailliertere Charakterisierung therapeutischer Antikörper, einschließlich der N- oder C-terminalen Sequenzierung, der Charakterisierung von Glykanen und anderer Aspekte der Antikörperproduktion, -analyse, -aufreinigung und -fragmentierung kann die Produktentwicklung besser informiert werden. Die Massenspektrometrie in der Proteomik liefert zusätzliche Strukturinformationen.

Posttranslationale Modifikationen

N-Glykan-Analyse

Eine hochgradig variable Glykosylierung kann die Reinheit von mAk beeinträchtigen und zu einer variablen Funktion führen. Monoklonale Antikörper tragen N-Glykane auf ihrem Backbone, die mittels LC-MS freigesetzt werden können, um die Glykosylierungsmuster zu bewerten. Die Charakterisierung der N-Glykane eines monoklonalen Antikörpers ist erforderlich, um vollständige strukturelle Details des untersuchten Moleküls zu erhalten. Das Verständnis dieser N-Glykan-Pfade ist wichtig, da N-Glykane viele Eigenschaften von Glykoproteinen beeinflussen, darunter ihre Konformation, Löslichkeit, Antigenität und Erkennung durch glykanbindende Proteine.

Vergleich monoklonaler Antikörper (mAk) mit Strukturen höherer Ordnung (HOS)

Viele Faktoren beeinflussen HOS - die 3D-Struktur eines mAk - von der Wahl der Zelllinie für die mAk-Produktion bis hin zu den Bioprozessbedingungen wie Temperatur, pH-Wert und Lichtexposition. Die Wasserstoff-Deuterium-Austausch-Massenspektrometrie (HDX-MS) ist eine Methode, die einen detaillierten Einblick in die Tertiärstruktur des mAk ermöglicht.

Analyse der mAk-Modifikation

Während des mAk-Herstellungsprozesses können viele verschiedene posttranslationale Modifikationen auftreten, die stark von Prozessparametern wie Medien, Temperatur usw. beeinflusst werden. Um ein konsistentes Produkt herzustellen, ist es entscheidend, dass diese Modifikationen bei jedem Durchlauf der mAk-Synthese reproduziert werden. Die Modifikationsanalyse umfasst die Kartierung von Disulfidbrücken und die Bewertung der Glykan-Grundstruktur. Es ist auch ratsam, die Sialylierung zu quantifizieren, da Sialinsäure einen negativen Effekt auf mAk haben kann.

mAk-Ladungsverteilung

Durch posttranslationale Modifikationen (PTM) oder chemische Modifikationen können Ladungsvarianten einen erheblichen Einfluss auf die biologische Aktivität und Pharmakokinetik eines mAk haben. Die Analyse von Ladungsvarianten, die für mAk gesetzlich vorgeschrieben ist, kann mit Techniken wie der Kationenaustauschchromatographie (CEX) und der Kapillar-isoelektrischen Fokussierung (cIEF) durchgeführt werden.

Physikalische Testverfahren und Größenverteilung von mAk

Physikalische Testverfahren von mAk

Physikalische Tests dienen der Charakterisierung des Erscheinungsbildes eines mAk, z. B. der Messung von pH-Wert, Osmolalität und Konzentration. Die Packungsintegrität wird auch im Rahmen des physikalischen Prüfprotokolls bewertet, zum Beispiel die Karl-Fischer-Feuchtigkeitsanalyse oder das Eindringen von Farbstoffen zur Bestätigung der Dichtigkeitsprüfung.

Größenverteilung von HmAk

Obwohl ein einzelnes mAk-Produkt erwünscht ist, enthält das ursprüngliche Produktionsmaterial oft Größenvarianten wie Aggregate, Fragmente und Biomoleküle, die zusätzliche leichte Ketten aufweisen. Da diese die Immunogenität und Wirksamkeit beeinträchtigen können, ist es wichtig, ihr Vorhandensein zu überwachen. Die Größenausschlusschromatographie (SEC) ist die am häufigsten verwendete Methode zur Bewertung der Größenverteilung.

Sterilität & Verunreinigungen

Verunreinigungen von Wirtszellproteinen

Verunreinigungen von Wirtszellproteinen (HCP), die in Biotherapeutika in ppm-Mengen vorhanden sind, stellen ein großes Immunogenitätsrisiko dar, da sie bei Patienten eine unvorhersehbare Immunreaktion auslösen können. Ihre komplexe und vielfältige Natur macht es schwierig, sie zu entdecken oder zu überwachen. Während die meisten HCP-Verunreinigungen in den üblichen nachgelagerten Aufreinigungsverfahren wirksam entfernt werden können, stellen einige wenige HCP eine besondere Herausforderung dar. Knockouts eines schwer zu entfernenden CHO-HCP, der Lipoproteinlipase, wurden entwickelt, um die Stabilität von Polysorbaten in monoklonalen Antikörperformulierungen zu verbessern.

Überwachung von Herstellungszusätzen

Während der mAk-Entwicklung und -Herstellung muss eine Vielzahl von Herstellungszusätzen überwacht werden, darunter Detergenzien, Protein A, Transfektionsreagenzien, Antibiotika, Entschäumer und Wachstumsfaktoren.

Mikrobielle Testverfahren von mAk

Für die GMP-konforme Entwicklung und Herstellung von Arzneimitteln ist eine Vielzahl von mikrobiologischen Prüfverfahren erforderlich. Viele mAk werden in Mikroorganismen hergestellt, um von hohen Wachstumsraten und Ausbeuten zu profitieren. Aus diesem Grund ist es wichtig, das Vorhandensein von mikrobiellen Verunreinigungen zu überwachen und zu kontrollieren. Ein Bestandteil der Zellwand gramnegativer Bakterien, das sogenannte Endotoxin, ruft Reaktionen hervor, die von Fieber und Schüttelfrost bis hin zu einem tödlichen septischen Schock reichen. Daher sind der Nachweis von Pyrogenen (MAT-In-vitro-Tests) und die anschließende Entfernung aus dem mAk von entscheidender Bedeutung und eine gesetzliche Vorschrift. Keimbelastungsprüfungen sollen während des gesamten mAk-Herstellungsprozesses durchgeführt werden, um das Vorhandensein einer potenziell schädlichen mikrobiellen Kontamination zu überwachen. Sterilitätsprüfungen sind ebenfalls wichtig, um die Integrität der mAk-Produktion zu bestätigen.

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