Recuento y análisis de la salud celular

Deben contarse las células del cultivo para controlar el tiempo de duplicación y para cuantificación antes de los experimentos o los procesos de fabricación. Las células cultivadas requieren un control sistemático para comprobar no sólo la proliferación, sino también la viabilidad, la citotoxicidad y otros parámetros de salud celular. La elección del análisis depende del tipo de células en cultivo, de la aplicación del estudio y del rendimiento deseado. Es fundamental cuantificar, o contar, las células cultivadas antes de subcultivarlas o de su uso posterior en transfecciones, estudios genómicos, crioconservación u otras manipulaciones.

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Recuento celular manual

Las cámaras de recuento celular, como el hemocitómetro con cuadrículas Neubauer, son dispositivos comunes para el recuento celular manual o visual. Se carga una pequeña alícuota de la suspensión celular en la cámara de un dispositivo de vidrio cuadriculado mediante esmerilado de precisión, en el que se dispersa por acción capilar sobre la cuadrícula grabada. Las células se visualizan al microscopio y se cuentan utilizando un contador manual. El volumen predefinido de la cámara y el sistema de cuadrícula se utilizan para calcular la concentración celular. Existen sistemas basados en imágenes que automatizan el proceso de conteo.

Recuento celular automático

En muchos dispositivos de recuento celular automático se utilizan los mismos colorantes y principios de recuento visual utilizados en la hemocitometría. A diferencia de los contadores automáticos de células, que se basan en el reconocimiento del objeto, los dispositivos basados en el principio Coulter han ganado popularidad por su usabilidad y precisión. Los contadores Coulter bombean las suspensiones celulares a través de un sensor que detecta las células en función de un cambio en la resistencia eléctrica. Esto permite una detección más fiable de las células, incluso de las células pequeñas, y recuentos celulares de gran precisión. Los modelos portátiles que caben en la mano (similares a una pipeta) permiten conteos celulares directos desde la campana de cultivo.

Ensayos de viabilidad celular

Síntesis de ADN: El control de la síntesis activa de ADN en las células es la base de algunos ensayos de proliferación celular. La replicación del ADN puede medirse incorporando nucleósidos modificados, como la 3H-timidina radiactiva o la bromodesoxiuridina no radiactiva (BrdU) que se detecta con un anticuerpo.

Actividad metabólica: Los ensayos calorimétricos que miden la actividad metabólica son adecuados para analizar la proliferación celular, la viabilidad celular y la citotoxicidad. La reducción de sales de tetrazolio como MTT, XTT y WST-1 a compuestos formazán coloreados sólo se produce en las células metabólicamente activas. La presencia de ATP también es un indicador de actividad metabólica. En el ensayo del gen reportero de luciferasa de luciérnaga, el ATP producido por las células en división se utiliza para oxidar la D-luciferina, que produce una luz bioluminiscente, que puede leerse.

Exclusión del colorante: La tinción azul de tripano se utiliza comúnmente para el recuento celular viable. Este método se basa en el principio de que las células vivas no absorben el colorante, mientras que las células muertas absorben el colorante y aparecen azules al microscopio.

Ensayos fluorescentes de viabilidad celular: El marcaje con éster N-succinimidílico de diacetato 5(6)-carboxifluoresceína (CFSE) es una opción popular para medir el número de ciclos de división celular completados en una población celular. Otro colorante permeable a la membrana, la calceína-AM, no es fluorescente por sí misma, sino que emite una fuerte fluorescencia verde cuando es hidrolizada en una célula viable. Por el contrario, el colorante nuclear yoduro de propidio (PI) sólo puede llegar al núcleo atravesando la membrana dañada de las células muertas. Dado que tanto la calceína como el PI-ADN pueden excitarse con luz de 490 nm, es posible el control simultáneo vivo/muerto con un microscopio de fluorescencia de excitación.