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PCR cuantitativa (qPCR)

qPCR basada en SYBR Green

En la PCR en tiempo real o cuantitativa (qPCR) se utilizan moléculas reporteras fluorescentes que permiten la cuantificación de los productos amplificados. Como en la PCR convencional, se amplifica un molde de ADN, ADNc o ARN, pero en cada ciclo se controlan las señales fluorescentes para una cuantificación relativa o absoluta. Esta técnica es útil para numerosas áreas de investigación, como el análisis de la expresión génica, el genotipado, el análisis de microARN, los análisis de variación genética y los análisis de proteínas.

Cómo analizar los datos de la qPCR

La fluorescencia de las moléculas reporteras se mide y cuantifica; normalmente estas moléculas son o bien colorantes (es decir, SYBR® Green, bromuro de etidio), que se intercalan entre las bases de la doble hélice de ADN, o bien sondas diseñadas para unirse a una secuencia específica (es decir, balizas moleculares, sondas TaqMan® ) en el ADN.

Cuantificación relativa de los datos de la qPCR

Hay dos métodos principales de cuantificación de los datos de la qPCR. La cuantificación relativa, el método más común, utiliza la información ΔΔCt, mediante la cual se determina la proporción de expresión o abundancia del gen específico en la muestra, en comparación con un gen control, y se normaliza con la proporción de expresión de un gen de referencia. Dado que los valores de eficiencia E para los genes específico y de referencia difieren, este método también explica las diferencias en los valores de E. Este método se utiliza con más frecuencia en el análisis de la expresión génica.

Cuantificación absoluta de los datos de la qPCR

El segundo método, la cuantificación absoluta, es más común en microbiología medioambiental y hace uso de la curva patrón (SC). En el método de la curva patrón se utilizan series de dilución de la concentración de muestra conocida, N0, para crear una curva patrón utilizando la regresión lineal de log(N0) frente al ciclo umbral (CT). Esto se utiliza luego para calcular las concentraciones de molde de la muestra. La base de este método es que el valor de eficiencia de la muestra es el mismo que la del patrón.

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